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蛋白质组学研究,样本准备知多少?

文章出处:转载 作者:Lawson(洛尚中国) 人气: 59 发表时间:2018/3/15 17:01:13

俗话说好的开始是成功的一半,要想实验成功,除了要有好的idea,样本采集和预处理也至关重要。那么蛋白质组学研究中应该如何处理样本呢?今天咱们就来聊聊蛋白质组学研究中那些常见样本的准备!



动物篇

  • 取新鲜组织,剔除血管、脂肪、结缔组织等与研究无关的干扰组织;

  • 用生理盐水或PBS清洗血渍和污染物,用无尘吸水纸吸去表面液体;

  • 将组织剪切成边长 0.5 cm 小块或 100 mg 左右小块;

  • 将组织块用液氮速冻5 min以上,并于-80℃保存。


脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮肤等常规动物组织,定量蛋白质组推荐送样量>200 mg;修饰蛋白质组推荐送样量>500 mg。



植物篇

  • 地上部分在样本离体前用无菌水清洗杂质,水干后采集样本;地下部分在样本离体后,用预冷的PBS清洗杂质,无尘纸吸干后采集样本;

  • 去除非目标组织及衰老、霉变等干扰部分;

  • 样品剪切成小块,锡纸包裹或放入冻存管中;

  • 将组织块液氮速冻5 min以上,并于-80℃保存。

 

幼嫩的根、叶、花、愈伤组织等常规植物组织,定量蛋白质组推荐送样量>1g;修饰蛋白质组推荐送样量>2 g。



血液篇

血浆样本

  • 使用EDTA抗凝剂和蛋白酶抑制剂的血常规管采集血液;

  • 轻轻地上下颠倒混匀 8-10 次;

  • 立即4℃,1600 g离心 10 min;

  • 用移液器将血浆转移到离心管中,加入蛋白酶抑制剂,混匀,瞬时离心。


血清样本

  • 使用真空采血管收集血液;

  • 轻轻地上下颠倒混匀5-6 次;

  • 4℃,静置15-30 min;

  • 4℃,1600 g离心10 min;

  • 用移液器将上层淡黄色血清转移到离心管中,加入蛋白酶抑制剂,混匀,瞬时离心。

 

血浆/血清样本,定量蛋白质组推荐送样量>500 ul。



细胞篇

悬浮细胞

  • 细胞培养至2-5×105/ml,收集到15 ml离心管中,4℃,400 g-1000 g离心5-10 min,去上清;

  • 收集的细胞用10 ml PBS洗3次;

  • 1 ml PBS重悬细胞后转移到新的1.5 ml离心管;

  • 再次用上述条件离心,尽可能将上清去除干净;

  • 用适量PBS重悬,液氮速冻,并于-80℃保存

贴壁细胞

  • 细胞培养至覆盖度70-90%;

  • 去培养基,培养皿用10 ml PBS洗3次,培养皿倒扣,将液体控干;

  • 培养皿置于冰上,胰蛋白酶消化后,加入PBS悬浮细胞;

  • 收集到15 ml离心管中,4℃,400 g-1000 g离心5-10 min,去PBS;

  • 1 ml PBS重悬细胞后转移到新的1.5 ml离心管;

  • 再次用上述条件离心,尽可能将上清去除干净;

  • 用适量PBS重悬,液氮速冻,并于-80℃保存。


悬浮/贴壁细胞,定量蛋白质组推荐送样量>1×107个细胞或体积>50ul细胞沉淀;

磷酸化蛋白质组推荐送样量>5×107个细胞或体积>200ul细胞沉淀;

乙酰化、泛素化蛋白质组>1×108个细胞或体积>500ul细胞沉淀。



微生物篇

  • 离心法或其他方法分离菌和培养基;

  • 收集菌体到15 ml离心管,用10 ml PBS洗3次;

  • 用1 ml PBS 重悬菌体,转移到1.5 ml离心管中离心,用枪头吸去上清,记录菌的湿重或体积;

  • 用适量PBS重悬,每管100 ul分装,液氮速冻,并于-80℃保存。


微生物菌体,定量蛋白质组推荐送样量湿重>100mg或体积>100ul;修饰蛋白质组推荐送样量湿重>300mg或体积>300ul。



胶点胶条篇

胶点胶条

胶点/胶条或者泳道皆可,推荐考马斯亮蓝染色,要求条带清晰,无降解。


IP / Co-IP / Pull-down样本

蛋白洗脱液要求蛋白总量>5ug,蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳,下方两种电泳方式任选其一即可。

  • 蛋白洗脱液,跑分离胶5cm(不含浓缩胶的SDS-PAGE),切下5cm胶条,放入1.5ml离心管中。

  • 蛋白洗脱液,跑SDS-PAGE标准的胶,切下目标条带即可,放入1.5ml离心管中。


考虑到动物、植物、细胞、微生物、胶点胶条大家关注度较高,今天小编就先为大家介绍到这里,如果你手上有更加棘手的特殊样本,不知道如何处理,也可以给小编留言!分享完常见样本的采集和预处理,下期将会给大家整理不同类型样本蛋白质提取方法,敬请关注www.csb17.cn




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